间充质干细胞/间充质基质细胞（Mesenchymal Stem/Stromal Cells, MSC）的体外规模化扩增，是细胞治疗产业化的重要基石。在再生医学的璀璨星河中，MSC无疑是最引人注目的明星之一——它们拥有自我更新的能力、卓越的免疫调节功能以及促进组织再生的潜能，为治疗多种难治性疾病带来了希望。

长期以来，传统的体外细胞培养主要聚焦于可溶性化学因子（如细胞因子和生长因子）的研究，认为这些可溶成分是调控细胞行为的主要因素，因此在培养基及添加物的优化方面召开了大量工作。然而，体内天然细胞微环境的复杂性远超于此：它不仅包含可溶性生化信号，还包括不溶性的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）组分。这些基质既能给予固相化的化学信号，又能传递重要的生物物理信号，如拓扑结构、刚度和空间构型[1]。这些理化特性深刻影响着细胞的黏附、增殖、分化及组织形成[2]。

可以说，细胞、信号分子和细胞外基质三者共同调控着组织的发育与再生[3]。因此，在体外细胞培养中，除了细胞这一“主角”之外，配角也不再仅限于培养基等可溶成分。能够模拟天然细胞外基质关键特征的生物材料，早已成为不可或缺的重要角色，有助于着细胞培养从传统的平面培养平台向三维（3D）培养体系转变，从而缩小简易体外实验与复杂体内生物学之间的差距[4]。

本文将从机械生物学（Mechanobiology）与仿生学视角，深度剖析微环境如何重塑MSC状态、强化其旁分泌效能，并思考在规模化生产中，z6com时凯集团应如何选择真正的3D培养策略。

一、MSC的“生态系统”：微环境决定细胞命运

MSC在体内并非孤立存在，它们栖身于一个复杂的“生态系统”——干细胞微环境（niche）之中。这个微环境主要包括：

• 细胞外基质：给予物理支撑和固相化的生化信号；
• 邻近细胞：免疫细胞、内皮细胞等形成的细胞间通讯网络；
• 可溶性因子：细胞因子、生长因子等生化信号；
• 物理化学梯度：氧气、营养、代谢产物的空间分布。

大量研究表明，微环境的稳定性直接决定了MSC的增殖、分化和功能状态[5]。换句话说，MSC的“命运开关”，就藏在微环境之中。

二、二维培养的困境：当细胞被“误导”而衰老

在传统的体外细胞扩增中，基于塑料培养皿或培养瓶的单层培养工艺（monolayer，以下简称2D培养）存在的问题，远不止“效率低”这么简单。更深层次的问题是：它改变了MSC的生物学本质。

在2D培养环境中，MSC被迫经历形态上的强制拉伸（扁平化）、细胞极性改变、细胞-细胞接触减少以及机械信号的异常传导。长期如此，会导致分化能力下降、免疫调节功能减弱、细胞衰老加速等一系列不良后果。

已有研究指出，2D培养正顺利获得非生理性的机械力学微环境，悄然诱导细胞的表型漂移与衰老。聚苯乙烯培养皿的杨氏模量（Young’s Modulus）高达约3 GPa，而人体天然软组织（如骨髓、脂肪微环境）的硬度通常在0.1～100 kPa之间。这种指数级的力学差异，将MSC置于极端的机械应激状态[1]。

▲图 二维、三维贴附状态对比图

（左：3D培养，右：2D培养）

异常铺展与细胞骨架强直

在超硬基底上，MSC被迫产生极高的细胞内张力，表现为应力纤维的大量组装和极度扁平的“煎蛋样”形态。这种病理性肥大导致细胞核受到严重的机械压迫，进而改变了染色质的超微结构。

细胞周期停滞与复制性衰老

高基质刚度相关的2D培养环境及长期陆续在传代，被认为可顺利获得增强细胞骨架张力与机械信号转导，加速MSC的衰老进程。研究表明，在体外扩增过程中，MSC会逐渐出现端粒缩短、细胞增殖能力下降以及细胞周期向G0/G1期偏移等典型复制性衰老特征。同时，衰老MSC常伴随氧化应激水平升高及脂质过氧化增强，例如丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛（4-HNE）等相关指标的积累，这些变化与细胞功能下降及衰老表型维持密切相关[7]。

衰老相关分泌表型的毒性累积

进入复制性衰老的MSC不仅丧失增殖与分化能力，还会分泌大量促炎因子（如IL-6、IL-8）及基质金属蛋白酶（MMPs），即形成衰老相关分泌表型（SASP）。SASP不仅削弱了MSC的免疫调节功能，还会顺利获得旁分泌途径加速整个培养体系的微环境恶化[8]。

这种被视为“常规”的培养方式，可能导致MSC功能性下降和表型改变[6]。也或许在一定程度上解释了，为什么很多临床前研究结果令人鼓舞，但在规模化生产后疗效却变得不稳定。

三、三维微环境：从机械重塑到抗衰老

与2D培养形成鲜明对比的是，3D微环境顺利获得调节细胞骨架、激活抗衰老通路与自噬机制，将细胞重塑为更具活力、更接近生理状态的存在，从而显著逆转二维培养引发的细胞异态。

生长方式与骨架重塑：告别“摊大饼”

在2D贴壁培养中，极高的基底刚度强制诱导细胞铺展，细胞骨架沿二维平面无限延展[1]。这种“摊大饼”式的生长方式导致细胞表观直径非生理性增大（在高代次细胞中尤为明显），同时细胞骨架严重僵化——这正是二维培养细胞随代次增加逐渐衰老、直径异常增大的根本原因[7-8]。

相比之下，3D微环境（如微载体或细胞球）从底层改变了细胞的生长方式。弹性的三维空间限制了细胞的过度铺展，MSC在此环境中骨架排列更加灵活，形态得以恢复至接近体内生理状态[9]。这种三维约束使得MSC的细胞直径实现“生理性回归”，通常稳定在最具活力和分化潜能的黄金区间[10]，保留了更高的核质比。此外，3D球体培养还能赋予细胞更强的物理形变能力，从而大幅提升其微循环顺利获得率，降低静脉回输时的栓塞风险[9]。

细胞周期解救与衰老标志物清除

多项研究表明，3D球体培养可显著改善MSC的衰老表型。在该培养体系中，衰老相关标志物如SA-β-gal表达水平下降，细胞周期阻滞现象减轻（G0/G1比例降低），同时细胞增殖能力与功能状态得到部分恢复。这些变化提示三维微环境可能顺利获得重塑细胞-细胞及细胞-基质相互作用，从而缓解MSC的复制性衰老过程[7]。

另一项研究采用了交替2D培养与3D球体培养的策略，结果显示，相较于陆续在的2D培养，这种交替式培养能有效减缓MSC在长期扩增过程中的体积增大和衰老现象，进一步印证了3D微环境在维持细胞“年轻态”和功能性方面的独特价值[11]。

SIRT1抗衰老与ALDH3抗氧化网络的激活

多项研究表明，3D培养微环境可能顺利获得调控细胞氧化还原状态及衰老相关信号通路，影响MSC的功能与衰老表型。在该条件下，部分与衰老相关的分子指标如SIRT1及p16INK4a可能发生表达水平变化，同时细胞内氧化应激状态得到一定程度改善。此外，细胞抗氧化与醛类代谢相关体系的活性变化，也被认为可能参与脂质过氧化产物清除及ROS水平调控过程。总体而言，这些变化提示3D微环境可能顺利获得多通路协同作用减轻MSC的氧化应激负担[7]。

物理张力释放与YAP入核抑制

在3D多孔或悬浮环境中，黏着斑激酶（FAK）信号减弱，导致机械敏感转录因子YAP/TAZ从细胞核转移至细胞质并被降解，从而卸下了维持细胞高度紧张的“物理枷锁”[12-13]。

mTOR通路的负调控与自噬激活

3D微环境适度抑制了促衰老的mTORC1信号轴，温和激活AMPK-ULK1主导的细胞自噬。这一“深度大扫除”机制高效清除了功能失调的线粒体（Mitophagy），这一调控网络被认为在维持细胞稳态及调节衰老相关表型中发挥重要作用[14]。

▲图 3D微环境抗衰老的分子信号通路图

四、效能飞跃：旁分泌强化与外泌体产能爆发

在临床应用中，MSC发挥疗效的关键依赖于其旁分泌（Paracrine）机制。而3D培养，正将这一潜能推向了新的高度。

巨噬细胞M2极化与免疫调节因子的激增

最新研究揭示了MSC的免疫调节功能受到微环境力学信号的显著影响。在三维培养或更接近生理状态的环境中，细胞骨架张力及肌动蛋白（F-actin）组织方式发生改变，并可顺利获得调控YAP/TAZ等机械转导相关信号通路，影响MSC的功能状态。相关研究提示，这种力学调控可能进一步影响MSC对巨噬细胞极化方向的调节能力，使其更倾向于诱导抗炎表型，但其具体机制仍具有明显的情境依赖性[8]。此外，3D培养可使吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、前列腺素E2（PGE2）及肿瘤坏死因子诱导基因6（TSG-6）的分泌量提升数十倍[15]。

外泌体产能跃升：无细胞疗法的破局点

3D微环境显著促进了多囊泡体（MVBs）与细胞膜的融合。当3D培养与动态生物反应系统相结合时，MSC外泌体的总产能相比传统2D培养可实现惊人的20倍提升[16]。与此同时，3D培养来源的外泌体（3D-Exos）相比传统2D来源的外泌体（2D-Exos）发生了显著的内含物转变，内部富集了更多与组织修复密切相关的特定miRNA，实现了产能与药效的“双核爆发”[17]。

▲图 3D来源外泌体（3D-Exos）与2D来源外泌体（2D-Exos）的表征分析

(A) 用于获取培养上清并分离外泌体（EXO）的3D培养和2D培养MSC体系示意图。

(B) 第4天时，在载细胞微凝胶（cell-loaded microgel）中进行3D培养的MSC活/死染色图像。

(C) 2D-Exos和3D-Exos的透射电子显微镜（TEM）形态图。

(D) Western blot代表性结果，显示MSC、2D-Exos和3D-Exos中外泌体阳性标志物（CD9、CD63和TSG101）及阴性标志物（Calnexin）的表达情况。

(E) 2D-Exos和3D-Exos的产量比较。产量定义为：采用纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）测得的分离样品中外泌体颗粒总数，除以对应来源培养体系中的细胞数量。

(F) 2D-Exos和3D-Exos样品的粒径分布及颗粒浓度分析。

五、破局之道：3D培养的仿生学原理

如今，研究人员已开发出多种能够打破“2D魔咒”的3D培养技术。其中一种较为简化的方式是球状体（Spheroid）技术。该技术属于无支架（即无生物材料参与）的3D培养方法，不给予任何固体黏附表面，而是将细胞悬浮于溶液中，依靠细胞自身聚集或借助外力（如离心）强行促使细胞聚集成球状体。该方法操作简单，且能增强细胞-细胞间的相互作用。

对于在体内天然依赖细胞间连接的细胞类型（如上皮类细胞），这种强制的细胞-细胞相互作用无疑更接近天然状态。然而，球状体内部常形成梯度——表面细胞增殖活跃，中心细胞因营养匮乏而坏死，且球状体之间难以标准化，缺乏细胞与细胞外基质的相互作用，与体内的真实环境仍有差距。MSC属于基质细胞，其天然倾向是与ECM相互作用，过强的细胞-细胞接触反而会引发接触抑制，导致细胞增殖停滞。因此，尽管有研究表明MSC经球状体培养后可减小细胞尺寸、改变细胞骨架重组[7]，但真正的3D仿生培养远非简单的“悬浮”所能概括。

那么，什么是真正的3D仿生培养？其本质在于从机械力学到生化梯度的全面模拟与还原，核心目标是重建MSC在体内所处的干细胞生态位（Stem Cell Niche）。

顺利获得生物材料模拟ECM，是让3D培养技术更进一步贴近仿生的重要手段。其中，水凝胶是一种将细胞均匀包裹在三维网络中的培养方式[18]。这种方法可以模拟软组织的力学特性，并支持细胞与基质间的相互作用。然而，对于大规模生产而言，从水凝胶中“收获”细胞往往是一个破坏性过程，且细胞需要与水凝胶同时制备，批次间稳定性成为规模化生产的挑战。解决水凝胶规模化生产问题的思路，是将生物材料制备与细胞接种拆分为两步，即制成预制的生物支架。对于MSC及其他贴壁类细胞而言，预制的商业化微载体是现在最接近实现规模化生产、模拟细胞外基质的选择[19-20]。

一个理想的3D仿生培养体系，应当具备以下核心要素：

01 空间自由度（Spatial Freedom）：

释放Z轴的物理限制，允许细胞立体伸展。

02 连接模式的立体生化重塑（Adhesion & Matrix Shift）：

将2D环境中非生理性的、极度扁平的“细胞-人工硬质基底”重塑为三维立体交互：

细胞-细胞（Cell-Cell）通讯： 恢复N-钙黏蛋白（N-Cadherin）等介导的同源细胞连接。

细胞-天然基质（Cell-Endogenous ECM）包裹： 在3D微环境中，细胞不再只是贴附于塑料表面，而是能够分泌并组装自身的内源性ECM（如富含纤连蛋白和胶原的三维网络），将自身与周围细胞立体包裹，形成结构完整的仿生微组织（Micro-tissue）。

03 生化梯度（Biochemical Gradients）：

形成类似体内的氧分压、营养物质和代谢产物的微小梯度。

六、规模化生产中的明智选择

当z6com时凯集团将目光投向临床应用时，MSC的规模化生产面临三大核心挑战：如何保证细胞质量（维持干性、避免衰老）、如何控制生产成本、如何确保工艺的可重复性和安全性。在这样的背景下，3D多孔可降解微载体培养脱颖而出，成为符合产业化需求的优选方案。

从技术逻辑上看，z6com时凯集团之所以强调这是“真正的三维”，是因为它同时满足以下几个关键条件：

仿生性与保护性：给予物理支撑和生化信号的双重仿生，孔隙结构保护细胞免受过度机械损伤，维持干性；

动态性：可与生物反应器结合，给予流体剪切力（Fluid Shear Stress, FSS）。在传统的静态2D培养中，细胞周围的培养液几乎不流动，而在生物体内，细胞间质液、血液和淋巴液的流动会产生流体剪切力——这是一种重要的机械刺激。研究表明，在动态培养系统（如生物反应器）中，适当的流体剪切力可以促进物质交换，同时顺利获得机械传导途径激活细胞内的信号通路，增强MSC的成骨分化或免疫调节能力[21]；

可降解性与可放大性：可降解的特性极大简化了细胞收获和分离工序，工艺参数明确，易于从实验室规模放大至工业级生产。

而从商业逻辑上看，基于3D多孔微载体的培养工艺也正在重塑细胞药物的产业化路径：

01 降本增效：

在空间密度方面，一台50L的3D搅拌式生物反应器，其表面积产能可等效于数百个传统的10层细胞工厂，极大地缩减了B+A级高等级洁净厂房的面积需求。在人力成本方面，实现了从“劳动密集型”向“技术驱动型”的跃迁，人工成本呈断崖式下降。

02 监管合规与获批背书：

国内首款获批上市的MSC药物，正是运用了封闭、自动化、可线性放大的3D工艺。这表明，3D工艺已成为加速IND申报和实现商业化获批的重要解决方案之一。

七、警惕“伪3D”：不是所有微载体都是真正的三维

在2D向3D工艺转型的当下，企业往往容易陷入一个典型误区——“伪3D培养”：即认为只要使用了微球或微载体体系，就等同于实现了三维培养。事实上，这一认知存在明显偏差。

当前市面上涌现的多款可用于MSC培养的微载体，本质上仍属于以下几类结构：

实心微载体（Solid microcarriers）：结构类似“弹珠”，如聚苯乙烯塑料微载体；

微孔微载体（Microporous microbeads）：内部为亚微米级孔隙（submicron pores），如葡聚糖或其他糖类微载体；

褶皱微载体：表面具有坑状或褶皱结构（类似“月球表面”），如部分蛋白类微载体；

大孔微载体（Macroporous microbeads)：蜂窝状多孔微球，表面为十微米以上的开放式孔洞且内部孔隙连通，如3D可降解多孔微载体。

对于直径通常在10–20 μm的MSC而言，前三种微载体（直径约100–300 μm）并不能给予真正的三维生长空间。细胞仍然只能附着于外表面，发生极化并铺展，形成单层生长结构。换言之，这类系统本质上仍是“带曲率的二维培养”，而非真正的3D微环境。

真正能够给予3D微环境的微载体，应具备一个关键特征：大孔且连通的三维结构。当孔径大于细胞尺寸时，细胞可以主动迁移进入孔隙内部，与多方向孔壁形成接触，建立更接近体内的空间互作关系，从而打破二维培养中典型的“极化-铺展”行为，恢复更生理性的状态。

然而，需要强调的是：微载体的“孔径”和“尺寸”并非越大越好——这是当前很多研发团队容易忽视的第二个关键问题：

01 孔径过大的问题：

当孔径远大于细胞尺寸时，细胞难以同时接触多侧孔壁，更倾向于单侧附着，同时孔壁曲率降低，趋近于“平面”。其结果反而削弱了3D微环境的“包裹感”和空间信号调控能力。研究表明，足够高的主曲率会促进细胞聚集，并在大孔内形成潜在的保护性生态位，防止MSC分化并保持其干性，而曲率越低则越容易促进细胞分化[22]。

▲图 支架大孔孔径调控组织表型及基因表达（体外和体内）

（↑：上调，↓：下调）

02 微载体尺寸过大的问题：

更为关键的是，孔径增大往往意味着微载体整体尺寸的增大，而这会直接触及一个生理学的“硬限制”——物质扩散极限。大量研究表明，氧气等关键分子的有效扩散距离约为100 μm左右[23]。根据Krogh Cylinder模型，单个毛细血管所能供养的氧扩散距离通常不超过200 μm[24]。当这一距离被突破时，氧气无法有效到达中心区域，营养供应不足，代谢废物积累，最终导致细胞进入缺氧甚至坏死状态。

由此可以推导出一个关键的工程学结论：理想的3D培养结构，其特征尺寸应控制在扩散极限以内。具体而言，微载体直径建议不超过400 μm，更优范围为200 μm左右，以确保任意细胞到“外界环境”的距离不超过200 μm，从而维持有效的氧气与营养传输。

因此，在选择真正的3D微载体体系时，需要同时关注两个核心参数：孔径（决定是否为3D） 和尺寸（决定是否可存活），二者缺一不可。而那些仅顺利获得表面粗糙化或微结构修饰的实心微载体，本质上只是增加了附着面积或扰动细胞形态——细胞依然是在“表面”进行铺展生长，并未真正进入三维空间。

▲图 微载体电镜图

（左：表面褶皱结构-“伪”3D，右：连通多孔结构-“真”3D）

从2D向3D的跨越，不仅是培养模式的变更，更是让细胞回归本源的过程。选择真正的3D微环境体系，才能从源头上还原体内仿生环境，彻底突破细胞治疗与外泌体产能的效能瓶颈。正如Patrick Wuchter等人在综述中所言：“为了真实模拟体内的生理状况，先进的模型系统应基于排列在三维结构中的生态位细胞。”3D微环境不仅仅是给MSC换了一个“更大的房子”，更是给予了一个包含力学信号、拓扑结构和生化因子的精密调控系统。

在未来，当z6com时凯集团进行MSC的科学研究或工业化生产时，应当跳出传统的“平面思维”，优先选择能够真正模拟体内微环境的三维多孔微载体培养，这不仅是对细胞命运的尊重，更是通向临床成功转化的重要一步。展望未来，3D培养的应用不仅局限于提升细胞规模化生产的质量和数量，再生医学的最小治疗单元也将从“单细胞悬液”进阶为携带丰富内源性ECM网络的“3D微组织”——而这，将是另一个值得期待的话题。

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